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Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalogne, Espagne * Ces auteurs ont un aperçu de ce travail Equal Contexte de la contribution : L'acide hyaluronique (HA) est un polysaccharide naturel utilisé dans la production de produits de comblement cutané à des fins esthétiques.Comme il a une demi-vie de plusieurs jours dans les tissus humains, les produits de comblement dermiques à base d'HA sont modifiés chimiquement pour prolonger leur durée de vie dans le corps.La modification la plus courante dans les charges commerciales à base de HA est l'utilisation de 1,4-butanediol diglycidyl éther (BDDE) comme agent de réticulation pour réticuler les chaînes HA.Le BDDE résiduel ou n'ayant pas réagi est considéré comme non toxique à moins de 2 parties par million (ppm);par conséquent, le BDDE résiduel dans le produit de comblement final doit être quantifié pour assurer la sécurité du patient.Matériels et méthodes : Cette étude décrit la détection et la caractérisation d'un sous-produit de la réaction de réticulation entre le BDDE et l'HA dans des conditions alcalines en combinant la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (LC-MS).Résultats : Après différentes analyses, il a été constaté que les conditions alcalines et la température élevée utilisées pour désinfecter l'hydrogel HA-BDDE favorisaient la formation de ce nouveau sous-produit, le composé « propylene glycol-like ».L'analyse LC-MS a confirmé que le sous-produit a la même masse monoisotopique que le BDDE, un temps de rétention différent (tR) et un mode d'absorbance UV différent (λ = 200 nm).Contrairement au BDDE, il a été observé en analyse LC-MS que dans les mêmes conditions de mesure, ce sous-produit a un taux de détection plus élevé à 200 nm.Conclusion : Ces résultats indiquent qu'il n'y a pas d'époxyde dans la structure de ce nouveau composé.La discussion est ouverte pour évaluer le risque de ce nouveau sous-produit trouvé dans la production d'hydrogel HA-BDDE (HA dermal filler) à des fins commerciales.Mots clés : acide hyaluronique, filler dermique HA, acide hyaluronique réticulé, BDDE, analyse LC-MS, sous-produit BDDE.
Les charges à base d'acide hyaluronique (HA) sont les charges dermiques les plus courantes et les plus populaires utilisées à des fins cosmétiques.1 Ce produit de comblement dermique est un hydrogel, généralement composé de > 95 % d'eau et de 0,5 à 3 % de HA, ce qui leur donne une structure semblable à un gel.2 HA est un polysaccharide et le composant principal de la matrice extracellulaire des vertébrés.Un des ingrédients.Il se compose d'unités disaccharidiques répétitives d'acide (1,4)-glucuronique-β (1,3)-N-acétylglucosamine (GlcNAc) reliées par des liaisons glycosidiques.Ce modèle de disaccharide est le même dans tous les organismes.Par rapport à certaines charges à base de protéines (comme le collagène), cette propriété fait de l'HA une molécule hautement biocompatible.Ces charges peuvent présenter une spécificité de séquence d'acides aminés qui peut être reconnue par le système immunitaire du patient.
Lorsqu'il est utilisé comme agent de comblement dermique, la principale limitation de l'HA est son renouvellement rapide dans les tissus en raison de la présence d'une famille spécifique d'enzymes appelées hyaluronidases.Jusqu'à présent, plusieurs modifications chimiques de la structure de l'HA ont été décrites pour augmenter la demi-vie de l'HA dans les tissus.3 La plupart de ces modifications tentent de réduire l'accès de la hyaluronidase aux polymères polysaccharidiques en réticulant les chaînes HA.Par conséquent, en raison de la formation de ponts et des liaisons covalentes intermoléculaires entre la structure HA et l'agent de réticulation, l'hydrogel HA réticulé produit plus de produits de dégradation anti-enzymes que l'HA naturel.4-6
Jusqu'à présent, les agents de réticulation chimiques utilisés pour produire du HA réticulé comprennent le méthacrylamide, le 7 hydrazide, le 8 carbodiimide, le 9 divinyl sulfone, le 1,4-butanediol diglycidyl éther (BDDE) et le poly(éthylène glycol) diglycidyl éther.10 ,11 Le BDDE est actuellement l'agent de réticulation le plus couramment utilisé.Bien que ces types d'hydrogels se soient révélés sûrs depuis des décennies, les agents de réticulation utilisés sont des réactifs qui peuvent être cytotoxiques et, dans certains cas, mutagènes.12 Par conséquent, leur teneur résiduelle dans l'hydrogel final doit être élevée.Le BDDE est considéré comme sûr lorsque la concentration résiduelle est inférieure à 2 parties par million (ppm).4
Il existe plusieurs méthodes pour détecter la concentration de BDDE à faible résidu, le degré de réticulation et la position de substitution dans les hydrogels HA, telles que la chromatographie en phase gazeuse, la chromatographie d'exclusion stérique couplée à la spectrométrie de masse (MS), les méthodes de mesure de la fluorescence par résonance magnétique nucléaire (RMN) et Chromatographie liquide haute performance couplée à un réseau de diodes (HPLC).13-17 Cette étude décrit la détection et la caractérisation d'un sous-produit dans l'hydrogel HA réticulé final produit par la réaction du BDDE et de l'HA dans des conditions alcalines.HPLC et chromatographie liquide-spectrométrie de masse (analyse LC-MS).Étant donné que la toxicité de ce sous-produit du BDDE est inconnue, nous recommandons que sa quantification des résidus soit déterminée de manière similaire à la méthode habituellement effectuée sur le BDDE dans le produit final.
Le sel de sodium de HA obtenu (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japon) a un poids moléculaire d'environ 1 368 000 Da (méthode Laurent) 18 et une viscosité intrinsèque de 2,20 m3/kg.Pour la réaction de réticulation, le BDDE (≥ 95 %) a été acheté auprès de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).Une solution saline tamponnée au phosphate avec un pH de 7,4 a été achetée auprès de Sigma-Aldrich Company.Tous les solvants, l'acétonitrile et l'eau utilisés dans l'analyse LC-MS ont été achetés auprès d'une qualité de qualité HPLC.L'acide formique (98%) est acheté en qualité réactif.
Toutes les expériences ont été réalisées sur un système UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, USA) et connectées à un spectromètre de masse triple quadripôle API 3000 équipé d'une source d'ionisation par électrospray (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
La synthèse d'hydrogels HA réticulés a été lancée en ajoutant 198 mg de BDDE à une solution d'hyaluronate de sodium (NaHA) à 10 % (p/p) en présence d'un alcali à 1 % (hydroxyde de sodium, NaOH).La concentration finale de BDDE dans le mélange réactionnel était de 9,9 mg/mL (0,049 mM).Ensuite, le mélange réactionnel a été soigneusement mélangé et homogénéisé et on l'a laissé se dérouler à 45°C pendant 4 heures.19 Le pH de la réaction est maintenu à ~12.
Ensuite, le mélange réactionnel a été lavé à l'eau et l'hydrogel HA-BDDE final a été filtré et dilué avec du tampon PBS pour obtenir une concentration en HA de 10 à 25 mg/mL et un pH final de 7,4.Afin de stériliser les hydrogels HA réticulés produits, tous ces hydrogels sont autoclavés (120°C pendant 20 minutes).L'hydrogel BDDE-HA purifié est stocké à 4°C jusqu'à l'analyse.
Pour analyser le BDDE présent dans le produit HA réticulé, un échantillon de 240 mg a été pesé et introduit dans le trou central (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; volume 0,5 ml) et centrifugé à 10 000 tr/min à température ambiante 10 minutes.Un total de 20 µL de liquide pull-down a été collecté et analysé.
Afin d'analyser l'étalon BDDE (Sigma-Aldrich Co) dans des conditions alcalines (1 %, 0,1 % et 0,01 % NaOH), si les conditions suivantes sont remplies, l'échantillon liquide est de 1:10, 1:100 ou jusqu'à 1:1 000 000 Si nécessaire, utilisez de l'eau déminéralisée MilliQ pour l'analyse.
Pour les matières premières utilisées dans la réaction de réticulation (HA 2 %, H2O, 1 % NaOH et 0,049 mM BDDE), 1 mL de chaque échantillon préparé à partir de ces matières a été analysé en utilisant les mêmes conditions d'analyse.
Pour déterminer la spécificité des pics apparaissant dans la carte ionique, 10 µL de solution standard de BDDE à 100 ppb (Sigma-Aldrich Co) ont été ajoutés à l'échantillon de 20 µL.Dans ce cas, la concentration finale du standard dans chaque échantillon est de 37 ppb.
Tout d'abord, préparez une solution mère de BDDE avec une concentration de 11 000 mg/L (11 000 ppm) en diluant 10 μL de BDDE standard (Sigma-Aldrich Co) avec 990 μL d'eau MilliQ (densité 1,1 g/mL).Utilisez cette solution pour préparer une solution de BDDE de 110 µg/L (110 ppb) comme dilution standard intermédiaire.Ensuite, utilisez le diluant standard intermédiaire BDDE (110 ppb) pour préparer la courbe standard en diluant le diluant intermédiaire plusieurs fois pour obtenir la concentration souhaitée de 75, 50, 25, 10 et 1 ppb.Comme le montre la figure 1, on constate que la courbe étalon BDDE de 1,1 à 110 ppb présente une bonne linéarité (R2 > 0,99).La courbe standard a été répétée dans quatre expériences indépendantes.
Figure 1 Courbe d'étalonnage de l'étalon BDDE obtenue par analyse LC-MS, dans laquelle une bonne corrélation est observée (R2 > 0,99).
Abréviations : BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl éther ;LC-MS, chromatographie liquide et spectrométrie de masse.
Afin d'identifier et de quantifier les standards BDDE présents dans le HA réticulé et les standards BDDE dans la solution de base, une analyse LC-MS a été utilisée.
La séparation chromatographique a été réalisée sur une colonne LUNA 2,5 µm C18(2)-HST (50×2,0 mm2 ; Phenomenex, Torrance, CA, USA) et maintenue à température ambiante (25°C) pendant l'analyse.La phase mobile est constituée d'acétonitrile (solvant A) et d'eau (solvant B) contenant 0,1 % d'acide formique.La phase mobile est éluée par gradient d'élution.Le gradient est le suivant : 0 minute, 2 % A ;1 minute, 2 % A ;6 minutes, 98 % A ;7 minutes, 98 % A ;7,1 minutes, 2 % A;10 minutes , 2% A. Le temps d'exécution est de 10 minutes et le volume d'injection est de 20 µL.Le temps de rétention du BDDE est d'environ 3,48 minutes (allant de 3,43 à 4,14 minutes d'après les expériences).La phase mobile a été pompée à un débit de 0,25 mL/min pour l'analyse LC-MS.
Pour l'analyse et la quantification des BDDE par MS, le système UPLC (Waters) est associé à un spectromètre de masse triple quadripôle API 3000 (AB SCIEX) équipé d'une source d'ionisation électrospray, et l'analyse est réalisée en mode ions positifs (ESI+).
Selon l'analyse des fragments d'ions effectuée sur BDDE, le fragment avec l'intensité la plus élevée a été déterminé comme étant le fragment correspondant à 129,1 Da (Figure 6).Par conséquent, dans le mode de surveillance multi-ions (MIM) pour la quantification, la conversion de masse (rapport masse sur charge [m/z]) du BDDE est de 203,3/129,1 Da.Il utilise également le mode de balayage complet (FS) et le mode de balayage des ions produits (PIS) pour l'analyse LC-MS.
Afin de vérifier la spécificité de la méthode, un échantillon blanc (phase mobile initiale) a été analysé.Aucun signal n'a été détecté dans l'échantillon blanc avec une conversion de masse de 203,3/129,1 Da.En ce qui concerne la répétabilité de l'expérience, 10 injections standard de 55 ppb (au milieu de la courbe d'étalonnage) ont été analysées, résultant en un écart type résiduel (RSD) <5 % (données non présentées).
La teneur résiduelle en BDDE a été quantifiée dans huit différents hydrogels HA réticulés en autoclave BDDE, correspondant à quatre expériences indépendantes.Comme décrit dans la section « Matériels et méthodes », la quantification est évaluée par la valeur moyenne de la courbe de régression de la dilution standard BDDE, qui correspond au pic unique détecté à la transition de masse BDDE de 203,3/129,1 Da, avec une rétention temps de 3,43 à 4,14 minutes Pas d'attente.La figure 2 montre un exemple de chromatogramme de l'étalon de référence BDDE 10 ppb.Le tableau 1 résume la teneur résiduelle en BDDE de huit hydrogels différents.La plage de valeurs est de 1 à 2,46 ppb.Par conséquent, la concentration résiduelle de BDDE dans l'échantillon est acceptable pour une utilisation humaine (<2 ppm).
Figure 2 Chromatogramme ionique de l'étalon de référence BDDE 10 ppb (Sigma-Aldrich Co), transition MS (m/z) obtenu par analyse LC-MS de 203,30/129,10 Da (en mode MRM positif).
Abréviations : BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl éther ;LC-MS, chromatographie liquide et spectrométrie de masse ;MRM, surveillance de réactions multiples ;SM, masse ;m/z, rapport masse sur charge.
Remarque : Les échantillons 1 à 8 sont des hydrogels HA réticulés BDDE autoclavés.La quantité résiduelle de BDDE dans l'hydrogel et le pic de temps de rétention du BDDE sont également signalés.Enfin, l'existence de nouveaux pics avec des temps de rétention différents est également signalée.
Abréviations : BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl éther ;HA, acide hyaluronique ;MRM, surveillance de réactions multiples ;tR, temps de rétention ;LC-MS, chromatographie liquide et spectrométrie de masse ;RRT, temps de rétention relatif.
Étonnamment, l'analyse du chromatogramme ionique LC-MS a montré que sur la base de tous les échantillons d'hydrogel HA réticulés autoclavés analysés, il y avait un pic supplémentaire au temps de rétention plus court de 2,73 à 3,29 minutes.Par exemple, la figure 3 montre le chromatogramme ionique d'un échantillon HA réticulé, où un pic supplémentaire apparaît à un temps de rétention différent d'environ 2,71 minutes.Le temps de rétention relatif observé (RRT) entre le pic nouvellement observé et le pic du BDDE s'est avéré être de 0,79 (tableau 1).Sachant que le pic nouvellement observé est moins retenu dans la colonne C18 utilisée dans l'analyse LC-MS, le nouveau pic peut correspondre à un composé plus polaire que le BDDE.
Figure 3 Chromatogramme ionique de l'échantillon d'hydrogel HA réticulé obtenu par LC-MS (conversion de masse MRM 203,3/129,0 Da).
Abréviations : HA, acide hyaluronique ;LC-MS, chromatographie liquide et spectrométrie de masse ;MRM, surveillance de réactions multiples ;RRT, temps de rétention relatif ;tR, temps de rétention.
Afin d'exclure la possibilité que les nouveaux pics observés puissent être des contaminants présents à l'origine dans les matières premières utilisées, ces matières premières ont également été analysées selon la même méthode d'analyse LC-MS.Les matières premières analysées comprennent l'eau, 2 % de NaHA dans l'eau, 1 % de NaOH dans l'eau et le BDDE à la même concentration utilisée dans la réaction de réticulation.Le chromatogramme ionique du produit de départ utilisé ne montre aucun composé ni pic, et son temps de rétention correspond au nouveau pic observé.Ce fait écarte l'idée que non seulement le matériau de départ peut contenir des composés ou des substances susceptibles d'interférer avec la procédure d'analyse, mais qu'il n'y a aucun signe de contamination croisée possible avec d'autres produits de laboratoire.Les valeurs de concentration obtenues après analyse LC-MS du BDDE et des nouveaux pics sont présentées dans le tableau 2 (échantillons 1 à 4) et le chromatogramme ionique de la figure 4.
Remarque : Les échantillons 1 à 4 correspondent aux matières premières utilisées pour produire des hydrogels HA réticulés BDDE autoclavés.Ces échantillons n'ont pas été autoclavés.
Abréviations : BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl éther ;HA, acide hyaluronique ;LC-MS, chromatographie liquide et spectrométrie de masse ;MRM, surveillance des réactions multiples.
La figure 4 correspond au chromatogramme LC-MS d'un échantillon de la matière première utilisée dans la réaction de réticulation du HA et du BDDE.
Remarque : Tous ces éléments sont mesurés à la même concentration et au même rapport que ceux utilisés pour effectuer la réaction de réticulation.Les nombres des matières premières analysées par le chromatogramme correspondent à : (1) eau, (2) solution aqueuse 2% HA, (3) solution aqueuse 1% NaOH.L'analyse LC-MS est effectuée pour une conversion de masse de 203,30/129,10 Da (en mode MRM positif).
Abréviations : BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl éther ;HA, acide hyaluronique ;LC-MS, chromatographie liquide et spectrométrie de masse ;MRM, surveillance des réactions multiples.
Les conditions qui ont conduit à la formation de nouveaux pics ont été étudiées.Afin d'étudier comment les conditions de réaction utilisées pour produire l'hydrogel HA réticulé affectent la réactivité de l'agent de réticulation BDDE, conduisant à la formation de nouveaux pics (sous-produits possibles), différentes mesures ont été effectuées.Dans ces déterminations, nous avons étudié et analysé l'agent de réticulation BDDE final, qui a été traité avec différentes concentrations de NaOH (0 %, 1 %, 0,1 % et 0,01 %) en milieu aqueux, suivi ou non d'autoclavage.La procédure bactérienne pour simuler les mêmes conditions est la même que la méthode utilisée pour produire l'hydrogel HA réticulé.Comme décrit dans la section "Matériels et méthodes", la transition de masse de l'échantillon a été analysée par LC-MS à 203,30/129,10 Da.Le BDDE et la concentration du nouveau pic sont calculés et les résultats sont présentés dans le tableau 3. Aucun nouveau pic n'a été détecté dans les échantillons non autoclavés, quelle que soit la présence de NaOH dans la solution (échantillons 1-4, tableau 3).Pour les échantillons autoclavés, de nouveaux pics ne sont détectés qu'en présence de NaOH dans la solution, et la formation du pic semble dépendre de la concentration de NaOH dans la solution (échantillons 5-8, tableau 3) (RRT = 0,79).La figure 5 montre un exemple de chromatogramme ionique, montrant deux échantillons autoclavés en présence ou en l'absence de NAOH.
Abréviations : BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl éther ;LC-MS, chromatographie liquide et spectrométrie de masse ;MRM, surveillance des réactions multiples.
Remarque : Le chromatogramme du haut : L'échantillon a été traité avec une solution aqueuse de NaOH à 0,1 % et autoclavé (120 °C pendant 20 minutes).Chromatogramme inférieur : L'échantillon n'a pas été traité avec NaOH, mais autoclavé dans les mêmes conditions.La conversion de masse de 203,30/129,10 Da (en mode MRM positif) a été analysée par LC-MS.
Abréviations : BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl éther ;LC-MS, chromatographie liquide et spectrométrie de masse ;MRM, surveillance des réactions multiples.
Dans tous les échantillons autoclavés, avec ou sans NaOH, la concentration de BDDE était fortement réduite (jusqu'à 16,6 fois) (échantillons 5 à 8, tableau 2).La diminution de la concentration de BDDE peut être due au fait qu'à des températures élevées, l'eau peut agir comme une base (nucléophile) pour ouvrir le cycle époxyde du BDDE pour former un composé 1,2-diol.La qualité monoisotopique de ce composé est différente de celle du BDDE et ne sera donc pas affectée.LC-MS a détecté un déplacement de masse de 203,30/129,10 Da.
Enfin, ces expériences montrent que la génération de nouveaux pics dépend de la présence de BDDE, NAOH et du processus d'autoclavage, mais n'a rien à voir avec HA.
Le nouveau pic trouvé à un temps de rétention d'environ 2,71 minutes a ensuite été caractérisé par LC-MS.A cet effet, le BDDE (9,9 mg/mL) a été incubé dans une solution aqueuse de NaOH à 1 % et autoclavé.Dans le tableau 4, les caractéristiques du nouveau pic sont comparées au pic de référence connu du BDDE (temps de rétention environ 3,47 minutes).Sur la base de l'analyse de la fragmentation ionique des deux pics, on peut conclure que le pic avec un temps de rétention de 2,72 minutes montre les mêmes fragments que le pic BDDE, mais avec des intensités différentes (Figure 6).Pour le pic correspondant au temps de rétention (PIS) de 2,72 minutes, un pic plus intense a été observé après fragmentation à une masse de 147 Da.A la concentration de BDDE (9,9 mg/mL) utilisée dans cette détermination, différents modes d'absorbance (UV, λ = 200 nm) dans le spectre ultraviolet ont également été observés après séparation chromatographique (Figure 7).Le pic avec un temps de rétention de 2,71 minutes est toujours visible à 200 nm, alors que le pic BDDE n'est pas observable sur le chromatogramme dans les mêmes conditions.
Tableau 4 Résultats de caractérisation du nouveau pic avec un temps de rétention d'environ 2,71 minutes et du pic BDDE avec un temps de rétention de 3,47 minutes
Remarque : Pour obtenir ces résultats, des analyses LC-MS et HPLC (MRM et PIS) ont été réalisées sur les deux pics.Pour l'analyse HPLC, une détection UV avec une longueur d'onde de 200 nm est utilisée.
Abréviations : BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl éther ;HPLC, chromatographie liquide à haute performance ;LC-MS, chromatographie liquide et spectrométrie de masse ;MRM, surveillance de réactions multiples ;m/z, rapport masse sur charge ;PIS, produit Balayage ionique ;lumière ultraviolette, lumière ultraviolette.
Remarque : Les fragments de masse sont obtenus par analyse LC-MS (PIS).Chromatogramme du haut : spectre de masse des fragments d'échantillon standard BDDE.Chromatogramme du bas : Le spectre de masse du nouveau pic détecté (la RRT associée au pic BDDE est de 0,79).Le BDDE a été traité dans une solution de NaOH à 1 % et autoclavé.
Abréviations : BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl éther ;LC-MS, chromatographie liquide et spectrométrie de masse ;MRM, surveillance de réactions multiples ;PIS, analyse des ions produits ;RRT, temps de rétention relatif.
Figure 7 Chromatogramme ionique de l'ion précurseur 203,30 Da, et (A) le nouveau pic avec un temps de rétention de 2,71 minutes et (B) la détection UV du pic standard de référence BDDE à 3,46 minutes à 200 nm.
Dans tous les hydrogels HA réticulés produits, il a été observé que la concentration résiduelle de BDDE après quantification LC-MS était <2 ppm, mais un nouveau pic inconnu est apparu dans l'analyse.Ce nouveau pic ne correspond pas au produit standard BDDE.Le produit standard BDDE a également subi la même analyse de conversion de qualité (conversion MRM 203,30/129,10 Da) en mode MRM positif.Généralement, d'autres méthodes analytiques telles que la chromatographie sont utilisées comme tests de limite pour détecter le BDDE dans les hydrogels, mais la limite de détection maximale (LOD) est légèrement inférieure à 2 ppm.D'autre part, jusqu'à présent, la RMN et la SM ont été utilisées pour caractériser le degré de réticulation et/ou de modification de HA dans les fragments d'unités de sucre des produits HA réticulés.Le but de ces techniques n'a jamais été de quantifier la détection résiduelle de BDDE à des concentrations aussi faibles que celles que nous décrivons dans cet article (LOD de notre méthode LC-MS = 10 ppb).
Heure de publication : 01 septembre 2021